HA-Magnetic 免疫沉淀試劑盒（PROCAP HA-Magnetic IP/CoIP KIT）

貨號：PHM025

存儲條件：IP buffer存儲于-20°C，HA-Magnetic beads可在4℃保存1年，或在-80℃長期保存。請根據(jù)各組分適合儲存條件存放，并避免反復凍融。

試劑盒組分：

產品簡介：

LABLEAD的免疫沉淀beads是基于基因工程改造的納米抗體開發(fā)的；納米抗體由傳統(tǒng)抗體的重鏈可變區(qū)（VHH）組成，具有分子量小、親和力高、特異性強，且耐酸堿高溫環(huán)境等特點；基于納米抗體的優(yōu)點，LABLEAD的免疫沉淀beads避免了免疫沉淀結果出現(xiàn)輕重鏈污染的現(xiàn)象，并且節(jié)省實驗時間。

實驗步驟：

提示：盡量在4℃進行操作，洗脫蛋白方法一除外。

1.收集細胞：

根據(jù)實驗要求收集適量的細胞，通常每個免疫沉淀反應大約使用 10⁶-10⁷ 個細胞。

2.植物組織裂解處理：

取適量植物組織樣本（葉片等）放置于冷凍液氮中，之后將冷凍后得植物組織樣本放于研缽進行研磨，盡可能充分研磨破壞其細胞壁。加入500-1000ul RIPA 裂解液（已加蛋白酶抑制劑 PMSF 等）進行裂解，為了提高裂解效率，加入 200ul 玻璃粉充分震蕩 30min，裂解完成后 12000 rpm，離心 30min，吸取上清 置新的離心管中，棄去沉淀。

3. 裂解細胞：

根據(jù)實驗要求選擇使用溶液A或溶液B裂解細胞。在溶液A或溶液B中加入蛋白酶抑制劑，用500μl預冷的溶液A或溶液B重懸細胞；置于冰上30分鐘，可每10分鐘充分吹打一次；4℃，20,000g離心15分鐘，將裂解產物（上清）轉移到一個新的預冷管中，丟棄沉淀。

4. 平衡珠子：

振蕩充分混勻珠子， 吸取40μl HA-Nanoab-Magnetic beads到500μl預冷的溶液A或溶液B中，4℃，2,500g離心2分鐘，或利用磁性分離，丟棄上清液。

5. 結合蛋白：

將平衡好的beads加入到細胞裂解產物中，于4℃旋轉混合結合30min-1h。

6. 清洗珠子：

根據(jù)實驗要求選擇使用溶液C或溶液D清洗beads。4℃，2,500g離心2分鐘，或利用磁性分離，丟棄上清液。用500μl預冷的溶液C或溶液D重懸beads，4℃，2,500g條件下離心2分鐘，或利用磁性分離，丟棄上清液并重復洗滌3次。

7.洗脫蛋白

方法一：

加入20μl 2×SDS-sample buffer重懸beads。95℃，加熱10min充分變性，2,500g離心2分鐘或利用磁性分離收集上清，收集的產物可進行SDS-PAGE及免疫印跡分析。

方法二：

加入溶液E洗脫結合的蛋白，孵育時間30秒，期間不斷混勻，2,500g離心2分鐘或利用磁性分離收集上清，為了中和酸性的甘氨酸，立即加入5μl 1.0 M Tris（pH10.4）。

注意：為了提高洗脫效率可以重復這一步。收集的產物可進行SDS-PAGE及免疫印跡分析。

注意事項：

1、關于裂解液與裂解液的選擇：

裂解液A為溫和裂解液，裂解液B為強裂解液，請根據(jù)自己實驗樣本選擇相應的裂解液，如：若為胞質蛋白可選裂解液A或者A與B混合使用，若為核蛋白則可選擇裂解液B。

漂洗液C和漂洗液D的選擇（裂解液D為高鹽溶液，可能會破壞蛋白間較弱的相互作用），若兩個蛋白相互作用強，同時想減少非特異性，可選D；若兩個蛋白相互作用弱的優(yōu)先C。

2、盡量避免過多的反復凍融?？梢赃m當分裝后使用。

3、本產品僅供科研使用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。

4、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。